1. Princip elektroforézy

2. Volná elektroforéza

3. Elektroforéza na nosičích

  • elektroforéza v polyakrylamidovém gelu ( PAGE )
  • SDS elektroforéza
  • izoelektrická fokusace
  • dvojrozměrná elektroforéza

    4. Kapilární elektroforéza

  • volná kapilární elektroforéza
  • kapilární gelová elektroforéza
  • kapilární isoelektrická fokusace
  • izotachoforéza

    5. Afinitní elektroforéza


    1. Princip elektroforézy

    Elektroforéza je metoda, která využíváschopnosti nabitých částic v elektrockém poli.Vzhledem k tomu, že rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly, různě velké a různě nabité molekuly se budou pohybovat odlišnou rychlostí. Můžeme proto elektroforézu využívat k separaci látek a to především pro analytické účely, avšak elektroforézy se užívá také pro účely preparativní.

    2. Volná elektroforéza

    V klasické tzv. "volné" technice se elktroforéza provádí ve vodných roztocích tlumivých roztoků ( elektrolytu ) a částice putují směrem k elektrodě s opačnou polaritou rychlostmi, které jsou uměrné velikosti jejich náboje. Rychlost migrace a vzájemné oddělování částic je dáno též použitým gradientem napětí. Metoda je velice jednoduchá, ale její značnou nevýhodou je, že se separace snadno poruší konvenčními proudy v kapalině, které vznikají vlivem tepla, způsobeného průchodem elektrického proudu. Proto se této techniky používá velmi zřídka.

    3. Elektroforéza na nosičích

    Aby se odstranily nedostatky volné elektroforézy, tj. vznik konvenčních proudů a difuze, které výrazně zhoršují výsledky elektroforetické separace, začala se provádět elektroforéza na nosičích, nazývaná též zonální elektroforéza. Nosiče používané při elektroforéze musí mít obdobné vlastnosti jako nosiče pro rozdělovací chromatografii - musí být hydrofilní, nerozpustné ve vodě a měly by mít co nejmenší adsorpční schopnosti. Prvními použitými nosiči byly neklížený papír ( tzv. chromatografický ), acetát celulosy, škrob ( nezgelovatělý ) a celulosa. V současné době se jako nosiče používají hlavně gely, a to zejména agarosový gel, škrobový gel a pravděpodobně nejčastěji gel polyakrylamidový.

    Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu ( PAGE )

    Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu patři v současnosti k nejoblíbenějším elektroforetickým etchnikám. PAGE se velice velice hojně využívá především v analytice bílkovin, a to ke zjištění homogenity preparátu a různých stupních isolačního postupu a k částečně fyzikálně-chemické charakterizaci bílkoviny. Úspěšnost elektroforetické separace ve značné míře závisí na volbě vhodných podmínek pro provedení procesu, zejména na použitém pH. Rozhodující vliv na stupeň disociace skupin separovaných látek a tedy i na velikost jejich nábojemá pH prostředí. Látky, které se nacházejí v izoelektrickém stavu nenesou žádný vnější náboj a nebudou se proto v elektrickém poli pohybovat. Naopak látky nesoucí náboje se budou pohybovat ve směru elektrody s opačným nábojem, tedy kationty ke katodě a anionty k anodě. Velice důležitým faktorem při elektroforéze na nosičích, a tedy i při PAGE, je koncentrace gele, resp. stupeň zesítění gelu. Gel s většími či menšími póry se totiž mechanickou překážkou pro molekuly určité velikosti. Má-li se tedy separovaná směs dělit pouze na základě velikosti náboujů, nesmí gel bránit molekulamá v jejich průchodu. V případě různé velikosti separovaných molekul se pak vhodně zvolená koncentrace gelu ( vlastně porosita ) stává dalším faktorem ovlivňujicí separaci. Experimentální uspořádání elektroforézy geleu je dvojího typu. V obou případech se elektroforéza provádí ve speciálních aparátech, v nichž se nosič se vzorkem k separaci umístí mezi dvě elektrody, mezi nimož prochází stejnosměrný proud. Rozdíl mezi oběma typy je v umístnění vzorku. Starší metoda umisťuje gelový nosič se vzorkem vertikálně v trubičkách, v novějším je gel rozprostřen v tenké vrstvě horizontálně na destičkách ( plošná elektroforéza ). Plošné uspořádání má oproti uspořádání v trubičkách několik výhod: je citlivější, lze ho snáze kvantifikovat pomoví tzv. denzitometrů a na destičku lze nanést více vzorku ( do trubičky pouze jeden ), takže proces je efektivnější a jednotlivé vzorky lze lépe porovnávat. Přes tyto výhody nevytlačila dosud plošná ellktroforéza zcela elektroforézu v trubičkách, a to zejména proto, uspořádání v trubičkách je jednodušší a gely je možno velice snadno připravit i málo zkušeným uživatelem, takže lze snadno dosáhnout dobrých výsledků. Nemalý význam pro oblibu elektroforézy v trubičkách má i fakt, že zařízení pro tento typ elektroforézy je jednodušší a proto i podstatně levnějšínež pro elektroforézu plošnou. Větší problém je, má-li být elektroforéza na sloupci použita pro preparativní účely. Pak je totiž nutno separované látky z kolony eluovat, což se při analytickém způsobu nedělá. Na sloupec či spíše prstenec gelu se nanese směs separovaných látek. Elektroforetické podmínky se uspořádají tak, aby separované látky postupovaly shora dolů ( pH, polha obou elektrod ). Dolní část gelu zasahuje do žlábku, jímž kontinuálně velmu pomalu protéká pufr ev. jiný eluent. Ten odvádí látky, které postouppily až na konec gelového prstence, do skumavek na automatickém jímačifrakcí. Tímto způsobem dojde k oddělenému jímání jednotlivých frakcí. Doobrého výsledku separace lze dosáhnout pouze tehdy. jsou-li jednotlivé zóny látek na koloně dostatečně vzdáleny ( několik centimetrů ).


    Základní uspořádání plošné elektroforézy

    SDS elektroforéza

    Elektroforéza v polyakrylovém gelu s dodecylsulfátem sodným ( SDS ) je další elektroforetický způsob separace na základě velikosti molekul separovaných látek, jehož použití však je vymezeno specielně pro bílkoviny. SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně vysoký náboj, a proto ve vazbě na bílkovinu vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin a ty se pohybují v gelu jen podle velikosti. Všechny bílkoviny totiž váží SDS v konstantním poměru, asi 1,4g SDS na 1g bílkoviny, a tím charakteristicky mění svou konformaci. Výsledné komplexy SDS-bílkovina pak mají stejnou hodnotu povrchového náboje a jejich konformace se do té míry unifikuje, že relativní molekulová hmotnost bílkoviny odpovídá velikosti jejího komplexu s SDS. Experimentálně byla prokázána přímá úměrnost elektroforetické pohyblivosti komplexů SDS-bílkovina v polyakrylamidovém gelu a logaritmu relativní molekulové hmotnosti. Takto stanovené hodnoty rel.mol.hmotnosti se obecně uznávají pro účely charakterizace bílkovinného preparátu. Je však třeba počítat s tím, že SDS ovykle inaktivuje biologicky aktivní látky, zejména enzymy, a proto po elektroforetické separaci již nelze enzym specifickým způsobem ( tj. na základě své katalytické aktivity ) prokázat.

    Izoelektrická fokusace ( IEF )

    Izoelektrická fokusace je další metoda, která se realizuje elektroforetickou technikou. Zatímco elektroforéza na nosičích se provádí za konstantního pH, k separaci při izoelektrické fokusaci dochází v gradientu pH, který se ustaví mezi dvěma elektrodami. Separovaná látka se pohybuje vlivem el.proudu v gradientu pH až do okamžiku, kdy se dostane do oblasti pH shodné s jeho izoelektrickým bodem. Tam ztratí náboj, zastaví se a bude se v tomto bodě koncentrovat. IEF je tedy rovnovážná technika a současně elektroforetická technika s pravděpodobně nejvyšším stupněm rozlišení. Tímto způsobem je možno od sebe oddělit ( a tak identifikovat ) sloučeniny, jejichž izoelektrické body se od sebe liší o 0,001 pH jednotky. Vznik gradientu pH je založen na elektrochemické reakci, k níž dochází na elektrodách :

    na anodě 6H2O -> 4H3O+ + 4e-

    na katodě 4H2O + 4e- -> 2H2 + 4OH-

    Z toho vyplývá, že při průchodu stejnosměrného proudu se na anodě vytváří kyselé prostředí, na katodě alkalické. Představme si za této situace amfoterní substanci ( A ), jejíž pI = pH1. Jestliže pH > pH1, pak A ponese negativní náboj, zatímco v případě, že pH < pH1 ponese A náboj pozitivní. Vlivem elektrického pole se bude A pohybovat v takovém směru, aby dosáhla pH rovného svému izoelektrickému bodu. Tam se zaství ( ztratí náboj ) a bude se koncentrovat. Jesliže tato amfoterní sloučenina bude mít pufrovací kapacitu, pak ve svém izoelektrickém bodě vytvoří malou prodlevu pH. Existuje-li v roztoku více amfoterních substancí s pufrovací kapacitou, které se od sebe budou lišit svými izoelektrickými body, vytvoří se gradient pH. Bude-li v roztoku amfolytických substancí s vhodně rozmístěnými izoelektrickými body a s tlumivými kapacitami dostatečné množství, vytvoří se kontinuální pH gradient bez prodlev, neboť jednotlivé prodlevy se budou navzájem překrývat. Syntetické amfolyty, které jsou připraveny tímto způsobem, se nazývají amfolytové nosiče. Sloučeniny, které se používají pro tvorbu amfolytových nosičů, jsou nízkomolekulární látky a jejich úplně oddělení v elektrickém poli není možné, neboť velice rychle difundují a kromě toho se zóny jejich působení překrývají. Tím se výrazně liší od vysokomolekulárních látek, které se nejčastěji izoelektrickou fokusací separují. Nízkomolekulární amfoterní látky mají také výražně vyšší pufrovací kapacitu než látky vysokomolekulární, proto gradient pH, který se vytváří v elektrickém poli za přítomnosti amfolytových nosičů a vysokomolekulárních amfoterních sloučenin, je z převážné části diktován amfolytovým nosičem. Pro tvorbu gradientu pH se tedy používá směsi amfoterních látek, které po zavedení el.proudu vytvářejí gradienti pH. Amfolyty jsou tvořeny převážně směsí alifatických aminokarboxylových kyselin s širokým rozmezím izoelektrických bodů. Gradient pH se často tvoří v hustotním gradientu sacharózy, který stabilizuje fokusované elektrolyty proti difuzi. IEF se využívá převážně pro analytické účely, a to pro stanovení izoelektrických bodů separovaných látek, stanovení titračních křivek a identifikaci jednotlivých složek separované směsi. I při IEF se nejčastěji pracuje v trubičkách nebo na deskách, takže provedením IED připomíná PAGE, liší se však principem dělení a tím pádem i použitými chemikáliemi. Obvykle však je možno pro obě techniky využívat stejných zařízení. Izoelektrickou fokusaci je možno provádět i volně, tj. bez nosiče a v některých případech i bez stabilizujících médií ( tzv. autofokusace ). Tento způsob však lze provádět jen v některých speciálních případech a není příliš vhodný pro vysokomolekulární látky.

    Dvojrozměrná elektroforéza

    Při analýze komplikovaných vzorků často nevystačíme pro dokonalou separacis jednou z výše popsaných metod. Ke zlepšení separace je možno provádět prakticky libovolnou z popsaných elektroforetických metod postupně ve dvou navzájem kolmých směrech. Výhodné je, kombinujeme-li při tom dvě navzájem nezávislé elektroforetické metody ( např. v jednom směru isoelektrická fokusace, ve druhém směru SDS - PAGE ). Ačkoliv existuje celá řada možností kombinace dvou metod či dvakrát stejné metody v kolmých směrech, dvojrozměrná elektroforéza se nejčastěji provádí některým z dále uvedených způsobů:
    1. PAGE v trubičce se kombinuje s PAGE na desce. Nejprve se nechá proběhnout elektroforéza v trubičce. Gel z trubičky se pak podélně připolymeruje k připravené desce PAA gelu a nechá se proběhnout v druhém směru po desce.
    2. Kombinace PAGE s SDS - PAGE. Provádí se na desce. Po proběhnutí elektroforézy v jednom směru se deska otočí o 90° a vdruhém směru se nechá proběhnout jako SDS PAGE. Jde o kombinaci dvou principů: v jednom směru se látky separují podle náboje, ve druhém podle velikosti molekuly.
    3. Kombinace IEF a SDS - PAGE. IEF v prvém směru se provede v trubičce, která se pak připolymeruje k připravené PAA gelu a nechá se proběhnout v druhém směru v pupfru s SDS. Jde tedy o kombinaci dělení podle isoelektrického bodu a podle velikosti molekuly.

    4. Kapilární elektroforéza

    Zvláštním způsobem elektroforézy je tzv.kapilární elektroforéza, která vyžívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry. Tomuto způsobu elektroforézy se říká vysokoúčinná kapilární elektroforéza ( HPCE ) a provádí se několika způsoby - jako volná elektroforéza, gelová elektroforéza, ale i jako izoelektrická fokusace.

    Volná kapilární elektroforéza ( free-zone capillary electrophoresis )

    Provádí se v otevřené kapiláře naplněné elektrolytem. K separaci dochází kombinací vlivu elektroforetické migrace a elektroosmotického toku. Elektroforetickou migrací rozumíme pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Elelktroosmotický tok je tok elektrolytu způsobený nábojem vnitřní stěny kapiláry a aplikovaným potenciálem. Ve styku s elektrolytem mají silanové skupiny podél vnitřní stěny kapiláry tendenci ionizovat a vytvářet tak na rozhraní stěny kapiláry a elektrolytu elektrickou dvojvrstvu. Když se do systému zavede stejnosměrný proud, kationty v elektrolytu v blízkosti stěny kapiláry se pohybují směrem ke katodě a strhávají elektrolyt s sebou. Tak se vytváří elektroosmotický tok směrem ke katodě. Různě nabité molekuly v separovaném vzorku se pohybují různými směry podle náboje, ale všechny jsou neseny ve směru katody díky elektroosmóze. Kladně nabité molekuly dosáhnou katody jako první, neboť elektroforetická migrace i elektroosmotický tok mají stejný směr. Jestliže se za podmínek volné kapilární elektroforézy separují anionty, pak elektroosmotický tok elektrolytu a elektroforetická migrace mají opačný směr. Směr elektroosmotického toku však může být změněn přidáním povrchově aktivních chemických aditiv do elektrolytu.


    Kapilární elektroforéza

    Neutrální molekuly se při volné kapilární elektroforéze neseparují, ale pohybují se jako jeden pás. Separace těchto molekul však je možno dosáhnout přidáním micelárních aditiv ( např. SDS ) k elektrolytu. Neutrální molekuly mají k nabitým micelám různou afinitu a podle ní se během elektroforézy separují. Tato technika je známa jako micelární elektrokinetická kapilární chromatografie ( MECC ). Čas, který potřebují molekuly k pohybu kapilárou, závisí na řadě faktorů : na délce kapiláry, na elektroforetické pohyblivosti jednotlivých molekul, na použitém elektrolytu a na použitém napětí. Molekuly s různou elektroforetickou pohyblivostí budou samozřejmě k průchodu kapilárou potřebovat odlišnou dobu. Rychlost průchodu kapilárou však ovlivňuje i tvar, velikost a náboj částic, koncentrace elektrolytu, pH roztoku a délka a průměr použité kapiláry. Schopnost separace jednotlivých molekul vzorku se vyjadřuje jako celkový počet teoretických pater ( N ), který je v ideálním případě možno vypočíst ze vzorce


    Elektroosmotický tok kapilárou

    N = V/2D ( 1/L [ µA + µEO ] )

    kde V je napětí, D je difusní koeficient, l je efektivní délka kapiláry od nástřiku k detektoru, L je celková délka kapiláry µA je molekulární pohyblivost analytu a µEO je koeficient elektroosmotického toku. Z tohoto vzorce je patrné, že aplikace vyššího napětí vede k vyšší separační účinnosti. Vyšší napětí však současně zvyšuje elektrický proud a tedy i teplotu, což může způsobit konvekční promíchávání ev.jiné nežádoucí procesy. Na velikost proudu má vliv i koncentrace elektrolytu a rozměry kapiláry. Např.při prodloužení kapiláry nebo snížení jejího vnitřního průměru vzrůstá odolnost proti zvyšování napětí, takže velikost proudu i teplota se snižují.

    Kapilární gelová elektroforéza

    Pracuje s kapilárou, naplněnou různými typy materiálů ( podle separované směsi ). Kapilára může být naplněna agarosou nebo polyakrylamidovým gelem kovalentně vázaným ke stěně kapiláry. Tento typ elektroforézy má řadu společných rysů ( pokud jde o provedení ) s volnou kapilární elektroforézou. Je zde však několik významných rozdílů : separace vzorku nezávisí na toku elektrolytu ve směru elektrody, ale pouze na elektroforetickém pohybu nabitých molekul gelovou matricí směrem k elektrodě. Kromě elektroforetické pohyblivosti se při separaci uplatní též porosita použitého gelu, velikost separovaných molekul, poměr velikosti molekul a náboje a fyzikální dimenze roztoku. Svou roli při separaci hrají i faktory, které ovlivňují volnou kapilární elektroforézu, jako velikost napětí, délka a průměr kapiláry, pH a iontová síla elektrolytu. Jestliže mají separované molekuly velice blízkou molekulovou hmotnost, rozlišitelnost na základě velikosti molekuly je malá, ale je možno ji zvýšit přídavkem organických rozpouštědel, chaotropních sloučenin nebo micel do elektrolytu. Tato činidla totiž mění tvar, velikost a náboj separovaných molekul, takže mohou výrazně měnit schopnost separace.

    Kapilární isoelektrická fokusace

    Vyžaduje práci s kapilárami, jejichž vnitřní povrvh stěn je modifikován ( potažen ), čímž se minimalizuje elektroosmotický tok a separace probíhá pouze na základě elektroforatické migrace. kapilára se naplní směsí vzorku pro separaci a amfolytem ( elektrolyt disociovaný v širokém rozmezí pH ) a po zavedení proudu vytvoří amfolyt v kapiláře lineární pH gradient. Každá molekula separovaného vzorku pak migruje do míst, kde pH odpovídá jejímu isoelektrickému bodu a tam se zastaví. Vytvářejí se zóny molekul se stejným isoelektrickým bodem. Gradientový roztok pokračuje ve svém pohybu i mimo kapiláru a s tím se vyplavují nebo "elektroeluují" i zóny separovaných látek, aniž by došlo k jejich promíchání.

    Izotachoforéza

    Zvláštním případem kapilární elektroforézy je isotachoforéza. S jejím principem jsme se již částečně seznámili v kapitole o diskontinuální elektroforéze. Je to elektromigrační metoda, prováděná obvykle v kapiláře, která umožňuje dělení podle efektivní pohyblivosti alternativně aniontů nebo kationtů. Jestliže uvažujeme dělení aniontů ( pro kationty je situace analogická ), je vzorek obsahující směs aniontů vložen mezi vedoucí a koncový elektrolyt. Vedoucí elektrolyt se skládá z vedoucího aniontu, jehož pohyblivost je větší než pohyblivost nejrychlejšího aniontu vzorku a protiiontu ( kationtu ) s tlumivou schopností v dané oblasti pH. Koncový elektrolyt obsahuje koncový aniont, jehož pohyblivost je menší nežli pohyblivost nejpomalejšího aniontu vzorku. Po připojení elektrického pole se anionty začnou pohybovat a oddělovat podle svých efektivních pohyblivostí. Na počátku jsou přítomny vedle zón jednotlivých aniontů ještě směsné zóny aniontů. Po určité době dojde k vytvoření ustáleného stavu, v němž putují bezprostředně za sebou oddělené zóny, z nichž každá obsahuje pouze jeden aniont separované látky a protiiont, který je obsažen ve všech zónách. Tyto zóny a rozhraní mezi nimi se pohybují při konstantním proudu stejnou konstantní rychlostí ( odtud název iso-tachoforéza ). V tomto stavu je pro isotachoforézu charakteristický : - samozaostřující efekt ( důsledek stupňovitých změn intenzity elektrického pole v jednotlivých zónách ), rozhraní mezi zónami jsou velmi úzká a šíře rozhraní nezávisí na čase ani množstí separované látky - koncentrační efekt, tzn.že koncentrace separovaných látek v ustáleném stavu nezáleží na původní koncentraci vzorku, je konstantní v celém objemu zóny a lze jí regulovat koncentrací vedoucího iontu ve vedoucím elektrolytu.

    5. Afinitní elektroforéza

    Je zvláštní případ elektroforézy na nosičích. Princip této metody je obdobný jako u afinitní chromatografie: separované látky se pohybujejí vlivem elektroforetické pohyblivosti v gelu, v němž je imobilizován afinitní ligand, specifický alespoň pro jednu složku směsi. V důsledku tvorby specifického komplexu se ta složka, která má k ligandu specifickou afinitu, opožďuje v průchodu gelem, zatímco neaktivní látky putují normální rychlostí. Porovnáním pohyblivosti jednotlivých látek v gelu bez ligandu lze určit, které molekuly mají afinitu k použitému ligandu a ze stupně retardace a koncentrace imobilizovaného ligandu lze stanovit též disociační konstantu komplexu separovaná látka - ligand.

    Home