Moderní separační techniky, v podstatě chromatografické a elektromigrační metody, umožňují separaci velice složitých směsí a získání jednotlivých složek směsi ve velice čistém až homogenním stavu. Na rozdíl od klasických separačních technik, založených
většinou na fázových separacích, je frakcionace látek při chromatografii a elektroforéze dána odlišnou pohyblivostí jednotlivých složek směsi za daných podmínek.
Moderní separační techniky v současné době slouží nejen k preparativním účelům, ale i k účelům analytickým. Z původního přístupu, kdy se pomocí separačních metod oddělila stanovovaná látka od směsi a v čistém stavu pak mohla být bez nebezpečí interferencí
stanovena, se napojením detektorů na různých bázích, zapisovačů ev.computerů, přešlo k přímému chromatografickému či elektromigračnímu stanovení látek ve směsích. Tyto metody umožňují velice efektivním způsobem sledovat a stanovovat látky i ve velmi
složitých směsích, což by bylo jinými metodami neproveditelné.
Jak již jsem výše uvedl, chromatografické metody patří mezi separační metody, u nichž je oddělení látek založeno na různé migraci ( pohyblivosti ). U těchto metod jde pak konkrétně o migraci v systému dvou fází, z nichž obvykle jedna fáze je stacionární
( nepohyblivá ) a druhá mobilní ( pohyblivá ). Z hlediska molekulární kinetiky je chromatografie kontinuálním procesem, v němž je prouděním porušována a difuzí opětně nastolována rovnováha mezi látkami rozpuštěnými ve stacionární a mobilní fázi
chromatografického systému. Výsledkem je rozdílná rychlost migrace rozpuštěných látek.
Chromatografické metody tvoří široká skupina metod, založených na různých principech separace. Nejčastěji se rozlišují dvě hlavní skupiny chromatografických metod podle charakteru fází, a to plynová chromatografie ( GC ) a kapalinová chromatografie ( LC ).
Plynová chromatografie pracuje v systému plyn - pevná látka nebo častěji plyn - kapalina. Kapalinová chromatografie pak v systémech kapalina - kapalina ( LLC ) nebo pevná látka - kapalina ( LSC ). V dalším výkladu se budeme zabývat pouze kapalinovou
chromatografií.
Podle principu separace látek při kapalinové chromatografii rozlišujeme :
- adsorpční chromatografii
- chromatografii na iontoměničích
- rozdělovací chromatografii
je založena na různé schopnosti látek v roztoku adsorbovat se na povrchu pevné fáze - adsorbentu ( říkáme, že látky mají různou afinitu k adsorbentu ). Je to tedy chromatografie ve fázi pevná látka - kapalina ( LSC ).
Chromatografie probíhá ve dvou stupních - v prvém stupni dojde k adsorpci látek na adsorbent podle jejich afinity k adsorbentu ( látky s větší afinitou se zacyhtí dříve ), ve druhém stupni je třeba látky z vazby na sorbent uvolnit, desorbovat, což se
provádí buď prostou elucí ( vymytím ) nebo vytěsněním roztokem látky, která má k adsorbentu větší afinitu než navázaná látka.
Z metod adsorpční chromatografie dnes má mimořádný význam afinitní chromatografie, která je jejím zvláštním případem.
probíhá v systému dvou navzájem nemísitelných kapalin ( LLC ) a k separaci dochází na základě odlišnosti rozdělovacích koeficientů ( odtud její název ). Vzhledem k tomu, že v průběhu chromatografie nedochází k vazbě rozpuštěných
látek na některou z fází, jde o proces jednostupňových ( odpadá nutnost eluce ). V původním provedení obě kapaliny postupovaly protiproudně, v současné době se však již toto uspořádání nepoužívá, ale jedna z kapalných fází se zakotví na inertní pevný nosič
a stane se tak fází stacionární ( nepohyblivou ), zatímco druhá fáze přes tuto fázi přetéká ( fáze mobilní, pohyblivá ). Při normálním uspořádání je stacionární fází vodná fáze ( nebo fáze s vodou mísitelná ), fází mobilní pak fáze nepolární. Nosiči
stacionární fáze mohou býr látky, které jsou schopny adsorbovat značné procento vody aniž by se změnilo jejich skupenství ( zůstávají stále v pevném stavu ). Takových látek je celá řada, jmenujme např.neklížený papír, silikagel, dextrany ap. Toto
uspořádání umožňuje separovat směsi látek ve vodě rozpustných. Látky rozpustné v nepolárních rozpouštědlech je třeba separovat v tzv.chromatografii s převrácenou fází, při níž se stacionární fází stává fáze nepolární. Problémem až donedávna ovšem byly
inertní nosiče pro tento druh chromatografie a problém byl definitivně vyřešen až zavedením chromatografie s vázanou fází.
Chromatografii s vázanou fází ( BPC ) můžeme s určitými výhradami zařadit k chromatografii rozdělovací. Stacionární fáze, která v případě klasické chromatografie je zakotvena krátkodosažnými silami na enertním nosiči, se na nosič kovalentně anváže. K tomu
se ovšem používají speciální nosiče, nejčastěji podle literárních údajů se chemicky modifikuje silikagel, a to reakcí mezi silanovými skupinami a chlorsilanovou sloučeninou, jejíž uhlíkaté radikály určují charakter chromatografického materiálu. Jde-li o
radikály s krátkými uhlíkatými řetězci, sorbent bude mít povrch hydrofilní ( alkoholové, aminové a kyanoskupiny ). Alkylové řetězce s 8 - 22 uhlíky dodají sorbentu charakter hydrofobní a užívají se proto jako stacionární fáze převážně v chromatografii s
reversní ( převrácenou ) fází.
Speciálním případem rozdělovací chromatografie je i permeační gelová chromatografie, kdy nosičem stacionární fáze je gel a stacionární i mobilní fází je voda, tedy systém voda - voda. Stacionární fáze je však uzavřena v gelu, čímž je zajištěna
nemísitelnost s fází mobilní. Díky tomuto speciálnímu uspořádání se zcela mění charakter separace, neboť separaci podle rozdělovacího koeficientu podléhají pouze látky, které proniknou póry gelu k stacionární fázi. Separace tedy probíhá na základě tvaru a
velikosti molekul látek ve směsi. Protože látky, které proniknou dovnitř gelu musí opět difundovat ven a ve svém postupu kolonou se zdrží, postupují kolonou nejrychleji látky s velikou molekulou, které nejsou schopny póry gelu projít.
Chromatografie na měničích iontů
je LSC ( liquid-solid, tj.kapalina - pevná fáze ) chromatografie, jejíž pevnou fází je intoměnič ( v současné době nejčastěji nosič s navázanými nabitýmu skupinami ). Látky ve směsi se pak separují podle stupně ionizace skupin a jejich afinity k ionexu, tedy podle počtu ionizovaných skupin a velikosti jejich nábojů. Je to opět dvoustupňový proces, neboť v prvé fázi se látky podle velikosti neseného náboje na ionexu zachytí a ve druhé fázi ( ve fázi eluční ) musí být z ionexu vytěsněny sloučeninami s větší afinitou k ionexu nebo změnou pH, přičemž dojde ke změně nábojových vlastností.
2. Chromatografické techniky
V průběhu posledních 2-3 desetiletí doznala kapalinová chromatografie značného rozvoje. Byly vyvinuty nové vysoce efektivní chromatografické materiály, což umožnilo provádět chromatografii za zvýšeného a vysokého tlaku. Vyvinul se typ chromatografie, který
se označuje HPLC ( high performance liquid chromatography ), tedy vysokoúčinná nebo též vysokotlaká ( P může znamenat i pressure ) kapalinová chromatografie. HPLC ovšem neznamenala ve vývoji chromatografie pouze zvýšení výkonnosti metody, ale vznikl typ
chromatografie na kvalitativně vyšší úrovni než chromatografie nízkotlaká. Přitom principy separace zůstávají stejné jako u chromatografie nízkotlaké. Z hlediska provozního můžeme tedy chromatografické metody dělit i podle pracovního tlaku na:
- chromatografii nízkotlakou ( též gravitační )
- chromatografii středotlakou ( FPLC - fast protein liquid chromatography ) - asi do 3MPa
- chromatografii vysokotlakou ( HPLC ) - 7-20MPa
Podle zůsobu umístění pevné fáze pak rozlišujeme:
- chromatografii na sloupci
- chromatografii v tenké vrstvě ( TLC - thin layer chromatography )
Chromatografie v tenké vrstvě se pouze zřídka používá jako prostředek stanovení skutečně kvantitativního. Jde spíše o semikvantitativní stanovení, ovšem nejčastěji slouží TLC jako prostředek identifikace látek ve směsi. Používá se převážně k separaci za
normálního tlaku.
Při TLC se chromatografický materiál rozestře v tenké vrstvě na desku z inertního materiálu ( sklo, hliníková folie ap. ), na desku se nanese vzorek ( obvykle současně se standardy ), deska se pomocí filtračního papíru či papírové vaty napojí na mobilní
fázi, která pak přetéká přes stacionární fázi.
Když mobilní fáze dojde k okraji desky, deska se vyjme, usuší a separované látky se musí na desce zviditelnit. Nechá se proto nejčastěji proběhnout příslušná barevná reakce podle typu separovaných látek, ev.se detekce provede některým z dalších způsobů popsaných v kapitole Elektromigrační metody. Desku je pak možno kvantitativně vyhodnotit densinometrem.
3. Instrumentace sloupcových chromatografií
Vybavení potřebné pro sloupcovou kapalinovou chromatografií se velice liší podle typu chromatografie, který budeme provádět. Zařízení pro nízkotlakou ( gravitační ) chromatografii je velice nenáročné a nezbytná je vlastně jen skleněná či plastiková kolona přednostně z průhledného materiálu. Naopak zařízení pro HPLC je vždy nákladné. I uvnitř těchto vymezených kategorií jsou značné rozdíly. Dnešní průměrně vybavená chromatografická laboratoř má i pro nízkotlakou chromatografii automatizaci, které umožňuje práci bez neustálé přítomnosti obsluhy. Pokud jde o HPLC zařízení, ta je možno nakoupit v nejrůznějších cenových relacích a podle toho i s odpovídajícím vybavením.
Nejmodernější přístroje tohoto typu jsou plně řízeny computery a zaručují přesnou a rychlou práci.
Zařízení pro chromatografii obsahují:
- kolonu s chromatografickým materiálem
- aplikátor vzorku
- čerpadlo a reservoár na mobilní fázi
- gradientový mixér
- detektor
- jímač frakcí
- výstup analyzovaných dat
Kolona s chromatografickým materiálem
je to nejdůležitější část zařízení. Na jejím výběru závisí úspěch separace a stanovení. Důležitá je nejen náplň kolony, ale i rozměry kolony. Chromatografický materiál se vybírá podle tho, jaký chromatografický princip
budeme k separaci používat, stejně tak rozměry kolony. Důležitá je i velikost částic chromatografického materiálu.
Zatímco pro laboratorní nízkotlakou chromatografii se používají kolony s délkou asi 10-200 cm a vnitřním průměrem 0,5-5 cm, které si většina spotřebitelů je schopna sama plnit chromatografickým materiálem, pro LHPLC se používají kolony kapilárního typu,
jejichž rovnoměrné plnění dostatečně jemným materiálem ( asi 3-10 µm ) je velmi náročné a používají se proto obvykle kolony dodávané komerčně. Obvyklé rozměry kolony pro HPLC jsou: vnitřní průměr 1-25 mm, délka 25-50 cm. Pro analytické účely se
používají kolony o vnitřním průměru 1-3 mm, širší kolony se používají pro gelovou chromatografii.
